Undersøgelse og evaluering af carcinogenese

Carcinogenese undersøges med forskellige standardiserede toksikologiske test. En første del af disse tests udføres in vitro, og - hvis de er positive - fortsætter vi med et in vivo -forsøg. Denne eksperimentelle trin-for-trin tilgang kaldes DECISION POINT APPROACH, en sekvens af forsøg, der stopper ved afslutningen af hvert forsøg for at beslutte, hvordan forsøget skal fortsætte. Der er fem faser:

FASE A: Den kræftfremkaldende forbindelses struktur og egenskaber;

FASEB: i denne fase af kortsigtet in vitro-test bruges pattedyrsceller. De mest almindeligt anvendte celler er hepatocytter, fordi omfanget af reparationen af den skade, som hepatocytten udvikler i henhold til sværhedsgraden af den skade, stoffet forårsager, studeres. I en nøddeskal bestemmer vi ikke selve skaden, men hvor meget af reparationssystemet, der er blevet aktiveret af levercellen.

Den implementerede procedure er at danne 3 hepatocytkulturer. I den første kultur er hepatocytterne sunde, i den anden behandles de med teststoffet og til sidst i den tredje behandles de med et kontrolstof, der bestemt er kræftfremkaldende.Disse tre kulturer indeholder en radioaktiv pyrimidinbase, som er tritieret thymidin, som fungerer som en markør.

Hvis den undersøgte forbindelse forårsager en mutation i DNA'et, reagerer cellen på dette problem ved at aktivere reparationssystemerne. Det stykke DNA, der har undergået mutationen, skæres og takket være virkningen af DNApolymerasen erstattes det manglende stykke med et nyt. Til korrektionen bruger DNApolymerasen de nye baser, herunder tritieret thymidin. En radioaktiv base er inkorporeret. Analysen af radioaktivitet bestemmer mutationsniveauet i de behandlede celler: jo højere radioaktivitet, desto større DNA -mutationer.

Også i fase B -tests udføres der også bakterier for at kunne undersøge, om der er omvendte mutationer. De anvendte bakterier er salmonellaer, der allerede er bærere af mutationer. Mutationen vedrører syntesen af histidin, så salmonella kan ikke vokse uden histidin. Disse bakteriekolonier tages dels for at blive behandlet med teststoffet, dels for den negative kontrol og dels for den positive kontrol, derefter testet med et kendt kræftfremkaldende stof. Hvis dette teststof er et indirekte genotoksisk middel, skal metaboliserende enzymer indføres i dyrkningsmediet. På dette tidspunkt er der 3 kulturer, der vil blive podet og dyrket i petriskåle (der er ikke histidin i dyrkningsmediet) .Hvis der ikke har været nogen mutationer af det kræftfremkaldende stof, der skal testes, burde der i teorien ikke være nogen på pladerne . Hvis der var en mutagen virkning af kræftfremkaldende stof, kan det have ændret den første mutation og skabt en anden mutation, der er i stand til at dyrke bakterierne på det histidinfrie dyrkningsmedium. I dette tilfælde den anden mutation, at den ændrer den første mutation og tager navnet RETROMUTATION Endelig, hvis der sker en betydelig vækst i piasta petri, er kræftfremkaldende direkte.
Altid med en in vitro -test er det muligt at bestemme den kromosomale integritet. Denne test udføres altid på pattedyrsceller og bruges til at teste giftige stoffer, der er i stand til at forårsage mutationer på nogle enzymer, der er ansvarlige for biosyntesen af DNA. Stoffet, der skal testes underkastes in vitro -analyse For at kunne afgøre, om stoffet, der undersøges, påvirker integriteten og antallet af tilstedeværende kromosomer, anvendes mikronukleustesten. Mikronuklerne er vesikler, der dannes med en del af kromatinet indeni. Kromatinet, der er inkorporeret i disse mikrokerner, kan enten være hele kromosomer eller fragmenter af kromosomer. Mikronuklerne dannes ved den forkerte celledeling, der giver anledning til datterceller med genetisk materiale ikke ens Resultatet af denne test vil være bestemmelse af stoffer, der er defineret klastogene og spindelgifte. Det klastogene stof producerer mikrokerner med acentriske kromosomfragmenter, så stoffet fremkalder et brud i kromosomerne, i stedet producerer spindelens giftstof af de mikrokerner, der inde i den er til stede hele kromosomer.
Hvis stoffet, der undersøges, fremkalder gentoksicitet i en eller flere tests, defineres dette som yderst mistænkeligt, så det går direkte til fase D. Hvis det testede stof på den anden side ikke frembringer nogen genotoksisk effekt, går det over i undersøgelsesfasen C fordi det kan være en promotor.

FASEC: i denne fase kan både in vitro og in vivo test udføres.

Til in vitro-tests kunne det påvises, at promotorsubstansen kunne bryde kløftforbindelserne mellem normale celler og tumorceller med deraf følgende passage af stoffer mellem de to celler.

En in vivo -test er induktion af hudtumorer hos mus. Det stof, der skal testes, påføres to eller tre gange om ugen på musens hud. Inden for 2/3 måneder, hvis dette stof er en promotor, kan der være papillomdannelser. Hos mus betragtes to hoveddata: antallet af mus påvirket af papillomer og antallet af papillomer, der er til stede på hvert dyr. Hvis stoffet fungerer som en promotor og udvikler en tumor i den behandlede mus, betyder det, at det faktisk er et stof med en promotoreffekt.

Når disse tests er gennemført, går vi videre til langsigtede in vivo-test.

FASERET: i denne fase testes alle de forbindelser, der viser sig mutagene, og alle de forbindelser, der ikke viser sig mutagene. De test, der kan udføres, er forskellige, hvoraf nogle er test udført på leveren, på lungen og til sidst på brystet.

Levertesten demonstrerer dannelsen af ikke en nydannet tumor, men af et neoplastisk fokus, derfor noget, der forbereder sig på at blive en tumor. Cellerne i dette fokus er allerede atypiske celler, derfor har de undergået en mutation og forbereder sig på at blive neoplastiske celler. Efter en vis tid, takket være obduktionsundersøgelsen, bestemmes dannelsen af præneoplastiske fokuseringer ved at beregne antallet og omfanget af disse præneoplastiske formationer.

Lungetesten tillader bestemmelse af et adenom, som er en "anomali i cellerne i lungevævet. Også i dette tilfælde undersøges rotteens lungevæv efter temmelig lang tid (måneder) (disse adenomer kan let identificeres pga. er hvidlige knuder på lungeepitelet).
Brysttesten muliggør bestemmelse af tumorer i kirtelvævet. Antallet af dannede adenomer og antallet af dyr, der præsenterer adenomer, evalueres altid.

Hvis der er positive resultater fra disse tests, er teststoffet virkelig et kræftfremkaldende stof. På dette tidspunkt går vi videre til at udføre dyre tests med meget lange udførelsestider.

FASE: i denne fase udsættes et variabelt antal dyr, fra 20 til 50, for langtidstest Disse test er meget dyre og tager lang tid at opnå visse resultater; vi taler om cirka 1/8 af dyrets liv. Det er muligt, at nogle dyr dør under processen med disse forsøg, men de studeres altid med en obduktion og histologisk typeundersøgelse. De valgte dyr er altid rotter og mus, og kun 70-80% overlever indtil afslutningen af de langsigtede test. De anvendte dyr er lige fravænnet, da jo yngre de er, jo mere følsomme er de for behandlinger. I løbet af den langsigtede testperiode understøttes forskeren altid af en matematiker-statistiker, der er i stand til at tage alle indsamlede oplysninger i betragtning og gengive de forskellige data.

Doserne testet på dyr starter fra den maksimalt tolererede dosis og alle dens submultipler, og dosis-responsreaktionen i dyret evalueres.
Administration skal altid nærme sig den vej, hvorigennem manden kan komme i kontakt med stoffet, der undersøges, derfor oral, kutan eller respiratorisk vej, mens hvis et lægemiddels kræftfremkaldende egenskaber testes, er det også nyttigt at udføre intravenøs administration.
De grupper af testede dyr er 4 (50 dyr for hver gruppe):

En NAIF -gruppe, der ikke har nogen behandling;
En gruppe behandlet med køretøjet;
En gruppe behandlet med teststoffet;
En gruppe behandlet med et kendt kræftfremkaldende stof.

Det er meget vigtigt, at antallet af dyr i hver gruppe er så lige som muligt. Faktisk, hvis der er for stor forskel i antallet af dyr, kan den statistiske test vise sig at være falsk.
De evalueringer, der udføres, er:

Total frekvens af tumorer;
Hyppighed af nogle tumorer;
Hyppighed af dyr med mere end én type tumor;
Antal kræftformer hos dyr.

Ved afslutningen af alle disse undersøgelsesfaser er stoffet klassificeret i en rangordning, der er fastlagt af IARC (International Agency for Research and Development on Cancer) og af Environmental Protection Agency (EPA).